蛋白质分离纯化技术PPT

蛋白质分离纯化技术是生物化学研究的重要手段，下面是蛋白质分离纯化的一些基本技术和方法：样品准备1.1 细胞破碎细胞破碎是蛋白质提取的第一步，常见的细胞破...

蛋白质分离纯化技术是生物化学研究的重要手段，下面是蛋白质分离纯化的一些基本技术和方法：样品准备1.1 细胞破碎细胞破碎是蛋白质提取的第一步，常见的细胞破碎方法有物理法、化学法和生物酶学法。物理法包括压碎、研磨、超声波等，其中超声波最为常用，因为它能够破碎不同类型的细胞化学法一般使用强酸或强碱，如盐酸-十二烷基硫酸钠（SDS）、氢氧化钠等生物酶学法利用特定的酶（如溶菌酶、蛋白酶等）破碎细胞1.2 蛋白质提取根据蛋白质的不同性质，选择不同的提取剂。常用的提取剂有：苯酚、三氯乙酸、硫酸铵等。蛋白质分离纯化2.1 根据分子量分离纯化透析是一种将溶液中的小分子物质与大分子物质分离开来的方法，主要用于去除蛋白质中的小分子杂质。凝胶过滤是一种根据蛋白质分子大小不同进行分离的技术，大分子不能进入凝胶内部的通道，而小分子则可以进入。超滤是一种膜过滤技术，通过不同孔径的超滤膜，将分子量不同的蛋白质分离。2.2 根据电荷分离纯化电泳是在电场作用下，带电粒子在介质中移动的现象。根据带电粒子在电场中的移动速度不同，可以将不同电荷的蛋白质分离开来。等电聚焦电泳是将pH梯度与电泳相结合的技术，可以分离等电点不同的蛋白质。离子交换色谱是一种利用离子交换剂将带电粒子从溶液中分离出来的技术，根据离子交换剂的电荷性质不同，可以选择性吸附不同电荷的蛋白质。2.3 根据疏水性分离纯化反相色谱是一种利用固定相与流动相之间的极性差异，将不同极性的化合物分离的技术。在反相色谱中，极性较小的蛋白质会被吸附在柱子上，而极性较大的蛋白质则会被洗脱下来。疏水相互作用色谱是一种利用蛋白质的疏水性质进行分离的技术。在疏水相互作用色谱中，通过改变流动相的极性或加入竞争剂，可以改变蛋白质与固定相之间的相互作用，从而使不同疏水性的蛋白质得到分离。2.4 根据生物学活性分离纯化免疫吸附纯化是一种利用抗原-抗体之间的特异性结合进行蛋白质纯化的技术。在免疫吸附纯化中，将特异性抗体包被在固相载体上，再将待纯化的蛋白质溶液通过该柱子，抗原-抗体复合物会吸附在柱子上，而其他杂质则会被洗脱下来。最后通过改变柱子的条件，使抗原-抗体复合物解离下来，得到纯化的蛋白质。功能活性纯化是一种根据蛋白质的生物学活性进行分离的技术。在功能活性纯化中，将细胞或组织中的蛋白质提取出来后，通过特定生物学反应将目标蛋白质与其他杂蛋白区分开来，从而得到纯化的蛋白质。例如通过细胞培养和转录因子结合反应分离纯化特定转录因子等。蛋白质鉴定3.1 化学鉴定法化学鉴定法是利用元素分析、红外光谱、质谱等手段鉴定蛋白质化学组成的方法。通过元素分析可以确定蛋白质中各种氨基酸的组成比例以及糖基、磷酸等附加基团的组成；红外光谱可以确定蛋白质的高级结构；质谱可以确定蛋白质的分子量以及侧链基团的组成。3.2 生物学鉴定法生物学鉴定法是通过蛋白质的功能和生物学活性进行鉴定的方法。例如检测蛋白质的表达水平是否增加或缺失，检测蛋白质修饰和变构是否发生变化，利用基因敲除或敲入技术研究特定基因对蛋白质表达的影响等。此外，生物学鉴定法还可以利用基因组学和蛋白组学技术来鉴定新发现的蛋白质及其功能。